Complex Systems • Infection Biology • Medicine

Research report (imported) 2017 - Max Planck Institute for Dynamics of Complex Technical Systems

Entwicklung eines neuen Rohr-Bioreaktors für die kontinuierliche Produktion von Influenza-Impfstoffen

Development of a novel tubular bioreactor for continuous production of influenza virus vaccines

Authors

Tapia, Felipe; Genzel, Yvonne; Reichl, Udo

Departments

Fachgruppe „Bioprozesstechnik“

DOI

10.17617/1.4R

Mit steigender Weltbevölkerung und rascher Ausbreitung alter und neuer Influenza-Viren sind effizientere Verfahren zur Impfstoffproduktion gefragt. Eine Option sind gekoppelte kontinuierliche Bioreaktoren. Leider führt die Anhäufung von defekten interferierenden Partikeln zu instabilen Virusausbeuten. Als Alternative haben wir einen neuen Rohrreaktor mit Pfropfenströmung entwickelt, in dem sich mit Suspensionszellen über drei Wochen hohe Ausbeuten an Influenza-Viren erzielen ließen. Dieses System kann auch für andere Viren genutzt werden und Impfstoffproduktionskosten weltweit verringern.
An increasing world population and fast spread of old and new influenza virus strains demands more efficient vaccine production methods. One approach is the use of coupled continuous bioreactors. Unfortunately, accumulation of defective interfering particles (DIPs) leads to unstable virus yields. As an alternative we have designed a novel plug-flow tubular bioreactor system, providing high influenza virus titers for up to three weeks in continuous mode using suspension MDCK cells. This novel platform can be used for other viruses and help reduce vaccine manufacturing costs worldwide.

Weiterhin besteht weltweit ein steigender Bedarf an Impfstoffen

Nach aktuellen Angaben der Weltgesundheitsorganisation WHO beträgt die jährliche Produktionsmenge von saisonalen Grippeimpfstoffen zum Schutz von Risikogruppen etwa 1,4 Milliarden Dosen [1]. Diese Impfstoffe werden traditionell in Millionen von bebrüteten Hühnereiern in einem etwa sechs Monate dauernden Prozess produziert. Allerdings werden seit einigen Jahren sowohl in Europa als auch in den USA neue, zellkulturbasierte Batch-Prozesse als effiziente Produktionsplattform etabliert [2]. Diese neuen Prozesse bieten insbesondere eine deutlich flexiblere Produktionstechnologie in einer aseptischen Umgebung (dem Bioreaktor) und vermeiden die Probleme der Bereitstellung sehr großer Mengen von Hühnereiern und den damit verbundenen hohen Vorlaufzeiten im Falle einer Pandemie. Die Weiterentwicklung der Herstellungsverfahren ist für die Zukunft unerlässlich, wenn die Weltbevölkerung bis 2050 auf 10 Milliarden ansteigt und wenn der Hauptteil der Weltbevölkerung (90%) in weniger entwickelten Regionen lebt [3]. Somit liegen die Herausforderungen der Influenza-Impfstoffproduktion für die nächsten Jahrzehnte in der weiteren Steigerung der globalen Produktionskapazität, einem einfacheren und schnelleren Zugang zu saisonalem und pandemischem Impfstoff in Regionen mit niedrigem Einkommen [1] und in der Entwicklung von effizienten und flexiblen viralen Impfstoffproduktionsplattformen.

Integrierte kontinuierliche Prozesslösungen könnten Kosten sparen

Ein Ansatz, der die Produktivität der Influenza-Impfstoffherstellung signifikant steigern und die Kosten reduzieren könnte, ist die Etablierung kontinuierlicher Prozesse. Eine Impfstoffproduktion im kontinuierlichen Modus könnte effizienter als der Einsatz der derzeitigen Batch-Systeme sein, da sowohl Reinigungs- und Sterilisationsschritte als auch Ausfallzeiten zwischen Produktionskampagnen, die bei Batch-Verfahren unabdingbar sind, entfallen. Außerdem haben kontinuierliche Prozesse nur einen geringen footprint (Platzbedarf), da in der Regel kleinere Bioreaktoren genutzt werden können. Dies erlaubt den Betrieb kostengünstigerer Anlagen als in Batch-Verfahren. Schließlich zeichnen sich kontinuierliche Verfahren dadurch aus, dass eine konsistentere und höhere Produktqualität erreicht werden kann.

Die Entwicklung von Produktionsanlagen zur integrierten und kontinuierlichen Herstellung von Impfstoffen setzt die Transformation aller Prozessschritte (unit operations), die zur Zeit im Batch-Verfahren durchgeführt werden, in eine kontinuierliche Prozessstrecke voraus. Dies betrifft neben dem Betrieb von Bioreaktoren zur Zellvermehrung und Virusproduktion (Upstream Processing) vor allem auch einige Aufreinigungsschritte (Downstream Processing), die auf Membranen angewiesen sind (Klärung und Konzentrierungsschritte), und Chromatographieprozesse (selektive Produktanreicherung und Abtrennung von Kontaminanten). Unterstützt wird die Etablierung dieser integrierten Prozesslösungen durch die zunehmende Verfügbarkeit von sterilen Einwegprodukten zur kontinuierlichen oder semi-kontinuierlichen Prozessierung pharmazeutischer Produkte, durch die die Kosten weiter gesenkt werden können.

Akkumulation von defekten interferierenden Partikeln erniedrigt die Virusausbeute

<strong>Abb. 1:</strong> Prozessschemata für zwei kontinuierliche Bioreaktorsysteme zur Produktion von Influenza-Viren. (a) Das 2-Kaskaden-Rührkesselr Bild vergrößern
Abb. 1: Prozessschemata für zwei kontinuierliche Bioreaktorsysteme zur Produktion von Influenza-Viren. (a) Das 2-Kaskaden-Rührkesselreaktor-System (two stage bioreactor, TSB) besteht aus einem kontinuierlichen Rührkessel (continuous stirred tank reactor, CSTR) zur Zellvermehrung, der mit einem zweiten Rührkessel zur Influenza-Virusproduktion verbunden ist. Am Anfang der Produktionsphase wird das Saatvirus einmalig in den zweiten Reaktor gegeben, wo es sich kontinuierlich vermehrt (Verweilzeit circa 25 h, Produktionsrate: 0,33 mL/min). (b) Ein Rohrreaktor mit Pfropfenströmung (Plug-flow tubular bioreactor, PFBR), der am Max-Planck-Institut für Dynamik komplexer technischer Systeme entwickelt wurde. Dieses Bioreaktorsystem besteht aus einem kontinuierlichen Rührkessel zur Zellvermehrung verbunden mit einem Rohrreaktor zur Virusproduktion. Der Rohrreaktor hat eine Länge von circa 105 m und einen internen Durchmesser von 1,6 mm (Verweilzeit: 20 h, Produktionsrate: 0,20 mL/min). [weniger]

Ein vorgeschlagenes Bioreaktorsystem für eine kontinuierliche Produktion besteht zum Beispiel aus einer Kaskade von zwei Rührkesseln (TSB-System; Abb. 1(a)). In diesem System wachsen die Zellen unter steady-state Bedingungen im ersten Rührkessel (CSTR: continuous stirred tank reactor), aus dem sie kontinuierlich in einen zweiten Rührkessel transferiert werden. In diesem zweiten Reaktor finden Virusinfektion, -vermehrung und -ernte statt. Obwohl in diesem System eine kontinuierliche Virusreplikation möglich ist, besteht bei längeren Prozesszeiten das Risiko der Anhäufung ungewollter Antigenvariationen. Dies betrifft insbesondere die Akkumulation von defekten interferierenden Partikeln (DIPs) in der Viruspopulation, wodurch es zu Oszillationen in der Virusausbeute kommt. Endkonsequenz daraus ist der Abfall der Gesamtproduktivität, bekannt als „von Magnus-Effekt“. Dieser Effekt wurde kürzlich bei einer kontinuierlichen Kultivierung einer Entenzelllinie (AGE1.CR, ProBioGen, Berlin) zur Produktion von Influenza-Virus A/PR/8/34 (Robert Koch-Institut, Berlin) über 18 Tage beobachtet. Die Influenza-Virustiter oszillierten sehr stark (über mehrere Log-Verdünnungsstufen von HA-Werten zwischen 2,3 bis 0,8, Abb. 2(a) links). Eine PCR-Analyse (polymerase chain reaction) zeigte mehrere zusätzliche PCR-Produkte in den verschiedenen Influenza-Gensegmenten, die deutlich auf eine Akkumulation von DIPs hinwiesen (Abb. 2(a) rechts) [4]. Ähnliche instabile Virusausbeuten im TSB-System wurden schon früher für die Produktion von Baculoviren beobachtet und konnten trotz vieler Bemühungen mit dem TSB-System nicht verhindert werden. Baculoviren wurden in der Vergangenheit vor allem für landwirtschaftliche Anwendungen genutzt, sind aber kürzlich auch zur Herstellung des ersten rekombinanten proteinbasierten humanen Influenza-Impfstoff lizensiert worden [5].

<strong>Abb. 2:</strong> Vergleich der kontinuierlichen Influenza-Virusproduktion mittels 2-Kaskaden-Rührkesselreaktor-System und einem Rohrreaktor mi Bild vergrößern
Abb. 2: Vergleich der kontinuierlichen Influenza-Virusproduktion mittels 2-Kaskaden-Rührkesselreaktor-System und einem Rohrreaktor mit Pfropfenströmung.
(a) Im 2-Kaskaden-Rührkesselreaktor-System oszillierten die Influenza-Virustiter über mehrere Log-Stufen während der Produktionszeit [3] (links). Eine Akkumulation von defekten interferierenden Partikeln (DIPs) sorgte für diese Oszillation, was mittels Influenza-spezifischer PCR-Analyse bestätigt wurde (rechts).
(b) Der Rohrreaktor mit Pfropfenströmung lieferte stabile Influenza-Virustiter (links) [6]. Die entsprechende Influenza-spezifische PCR-Analyse (rechts) zeigte stabile Produktion der viralen Gensegmente mit voller Länge mit nur sehr geringer Akkumulation von DIPs. Der von Magnus Effekt konnte somit vermieden werden. [weniger]

Bioreaktorsysteme mit Pfropfenströmung vermeiden Akkumulation von DIPs

Die Wissenschaftler der Gruppe „Bioprozesstechnik“ haben nun ein Bioreaktorsystem mit multiplen Stufen/Reaktoreinheiten zur kontinuierlichen Herstellung von Influenza-Viren entwickelt, das die Rückmischung und damit die Akkumulation von ungewollten Antigenvarianten sowie den von Magnus Effekt des TSB-Systems vermeidet. Das Reaktorsystem besteht ebenfalls aus einem CSTR zur Produktion der Zellen, verbunden mit einem Rohrreaktor mit Pfropfenströmung (PFBR; Abb. 1(b)) mit konstantem Mediendurchfluss [6]. Die Zellen werden kontinuierlich aus dem CSTR in das Rohr gepumpt und dort mit einem Saatvirus mit definierter Viruspassage infiziert. Anschließend bewegen sich Zellen und Viren gemeinsam in einer Pfropfenströmung durch das Rohr, wobei eine Verweilzeit von etwa zwanzig Stunden (ausreichend für einen kompletten Vermehrungszyklus der Viren in den Zellen) sichergestellt wird. Der wichtigste Unterschied des PFBR-Systems zum TSB-System ist das Vermeiden von Rückmischungen im Bioreaktor. Mit anderen Worten: Wenn die Zellen am Eingang des Rohrreaktors mit dem Virus infiziert werden, bewegen sich die Zellen durch das Rohr in einer Pfropfenströmung ohne Rückmischung mit den anderen, bereits vorher infizierten Zellen. Somit kommen die, vor allem am Ende des Rohrreaktors produzierten, DIPs nicht in Kontakt mit neuen nicht-infizierten Zellen und die Wahrscheinlichkeit von Ko-Infektionen, die zur verstärkten Produktion von DIPs führen, wird vermieden.

Erste Kultivierungen zeigten stabile Virustiter über mehrere Tage und die vorher beobachteten Oszillationen im Virustiter blieben aus. Außerdem wurden stabile Gensegment-Banden mittels PCR-Analytik bestätigt. Dieses Reaktorsystem wurde mit zwei Zelllinien, Madin-Darby Canine Kidney (MDCK, Hund) und AGE1.CR (Entenzelllinie), geprüft und eine stabile Produktion von Influenza-Viren mit hohen Titern war für bis zu drei Wochen möglich. Außerdem wurde über vier Wochen Prozesszeit keine Zellsedimentation im Rohr beobachtet, was für einen zuverlässigen, kontinuierlichen Betrieb ohne Ausfälle mit diesem Prozessaufbau spricht. Zur Zeit werden verschiedene Optimierungsansätze, wie zum Beispiel die Nutzung von Zellen mit einer höheren zell-spezifischeren Ausbeute, Maßnahmen zur Verbesserung der Vermischung innerhalb der „Pfropfen“ und der Einsatz anderer Virusstämme, getestet.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Bioprozesstechnik Gruppe eine leistungsfähige Prozessstrategie basierend auf einem Rohrreaktor entwickelt hat, die eine stabile Produktion von Influenza-Viren in einem kontinuierlichen Verfahren ermöglicht. Mit diesem Bioreaktorsystem können stabile Influenza-Virustiter mit definierter Virus-Passagenzahl erzielt werden. Damit wird auch das Risiko von Mutationen der viralen Antigene minimiert, die beim Einsatz von TSB-Systemen kaum zu verhindern sind. Damit eröffnet diese Plattformtechnologie die Möglichkeit, hocheffiziente zellkulturbasierte Prozesse für die Herstellung von Influenza-Lebend- oder -Totimpfstoffen zu entwickeln. Dies könnte nicht nur dazu beitragen, die Kosten zur Herstellung von Influenza-Impfstoffen deutlich zu reduzieren, sondern auch neue Wege zur kontinuierlichen Produktion anderer Viren eröffnen.

Literaturhinweise

1.
McLean, K. A.; Goldin, S.; Nannei, C.; Sparrow, E.; Torelli, G.
The 2015 global production capacity of seasonal and pandemic influenza vaccine
2.
Perdue, M. L.; Arnold F.; Li, S.; Donabedian, A.; Cioce, V.; Warf, T., Huebner, R.
The future of cell culture-based influenza vaccine production
3.
United Nations, Department of Economic and Social Affairs, Population Division
World Population Prospects: The 2015 Revision. United Nations, Department of Economic and Social Affairs, Population Division
4.
Frensing, T.; Heldt, F. S.; Pflugmacher, A.; Behrendt, I.; Jordan, I.; Flockerzi, D.; Genzel, Y.; Reichl, U.
Continuous Influenza Virus Production in Cell Culture Shows a Periodic Accumulation of Defective Interfering Particles
5.
Kompier, R.; Tramper, J.; Vlak, J. M.
A continuous process for the production of baculovirus using insect-cell cultures
6.
Tapia, F.; Genzel; Y.; Reichl, U.
Plug flow bioreactor, system containing the same and method for production of virus
 
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